惊厥发作会诱发GABA-A受体介导反应的反转电位产生兴奋性偏移正规配资十大排名，这可能导致脑电图记录的惊厥难以控制，并削弱如苯巴比妥等常用GABA能抗惊厥药物的疗效。研究人员发现，在新生大鼠和表达Clomeleon的转基因小鼠完整海马体中，通过Clomeleon成像技术检测到反复发作的惊厥会逐步提高神经元内氯离子浓度，并通过动作电位频率和细胞内钙瞬变检测证实GABA-A受体激活的净效应从抑制逆转为兴奋。这些变化与惊厥样事件频率的持续增加及苯巴比妥疗效减弱具有相关性。钠-钾-2氯协同转运蛋白NKCC1阻断剂布美他尼可抑制惊厥诱导的神经元氯离子积聚及由此引发的反复惊厥加剧现象。本研究揭示了惊厥活动导致神经元内氯离子积聚的新机制，这种积聚会提高后续惊厥发生的概率，为新生儿惊厥早期增强阶段提供了潜在机制解释。
一、介绍
神经元会对多种刺激产生反应，表现为GABAA受体介导的突触后电流反转电位发生长期偏移。例如，致癫痫性损伤会改变神经元氯离子转运——这是决定GABAA反转电位的主要因素。通过Clomeleon成像技术研究发现，持续惊厥活动或动作电位序列会促使GABAA反转电位持续向更正值（去极化）方向偏移。此外，氧糖剥夺和创伤等事件也会使GABAA反转电位向去极化方向移动。这种去极化变化会降低抑制效能并促进惊厥活动。
展开剩余96%未成熟神经元高表达NKCC1——一种电中性共转运蛋白，可介导钠、钾和氯离子的内流。这会提高细胞内氯离子浓度，导致GABAA反转电位去极化。在新生儿惊厥中，这种偏移可启动正反馈循环，同时会降低以GABA为靶点的抗惊厥药物疗效（这类药物是新生儿惊厥的一线治疗药物）。NKCC1可被低微摩尔浓度的袢利尿剂布美他尼选择性阻断。该利尿剂通过减少细胞内氯离子积聚，使GABAA反转电位向负电位方向移动，从而增强抑制效能。这种抑制增强效应具有显著抗惊厥作用，并能与延长GABAA受体介导氯通道开放概率的巴比妥类药物产生协同作用。
图1 完整新生儿海马体中静息氯离子分布与GABA能作用特征
a图显示表达Clomeleon探针的新生期（出生后7天）转基因CLM-1小鼠离体完整海马体CA3锥体细胞层的双光子荧光共聚焦扫描图像。上部为CA3神经元氯离子敏感YFP信号的共聚焦多层叠加图像（150个采样点，2微米步进），插图为完整海马体实物照片。下部为根据细胞内氯离子浓度进行伪彩色标注的神经元区域。
b图展示a图中81个单个神经元的静息氯离子浓度分布（组距2.5毫摩尔）。高斯拟合显示峰值位于17.4±0.6毫摩尔，分布宽度为14.6±2.3毫摩尔。多峰拟合显示三个峰值分别位于6.5±0.6、15.9±1和25.3±2.1毫摩尔。
c-e图显示异胍定对新生期（出生后5-7天）完整海马体标本多单元活动的影响：
c图为CA3锥体细胞层的细胞外多单元活动记录及相应频率变化。灌流应用异胍定（10微摩尔）可引起多单元活动频率的瞬时降低，红色曲线为峰值函数拟合结果。
d-e图展示单个海马体对异胍定的响应及相应的平均多单元活动频率（*p < 0.00002，双样本t检验）。多单元活动频率的降低表明GABAA受体激活的净效应为抑制性。
近期若干关于新生儿惊厥实验治疗的报告显示出相互矛盾的结果（表1）。例如，若在惊厥发作后立即给药，苯巴比妥的抗惊厥效果相对更强，而布美他尼疗效较弱。相反，在多次惊厥发作后给药的实验则表明，苯巴比妥疗效下降，而布美他尼等阻断NKCC1介导GABAA反转电位偏移的药物效果增强。本研究提出以下假设：活动依赖性、NKCC1依赖性的GABAA反转电位变化有助于决定新生儿惊厥的时序进程。该假设可解释表1所述实验环境中GABA能抗惊厥药效存在的显著差异。
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该假设具有重要临床意义：它为立即积极治疗新生儿惊厥提供了新依据——惊厥发作越频繁，GABAA反转电位偏移越显著，现有抗惊厥药物（如苯巴比妥）的有效率就越低，特别是在新生儿惊厥的增强期。由此推论，通过阻断NKCC1，布美他尼应能预防或减轻惊厥诱导的GABAA反转电位偏移，可能改善新生儿惊厥的增强模式。最后，布美他尼对GABA能抗惊厥药效的增强作用应随先前惊厥活动持续时间的延长而增加。这些假设已通过新生大鼠和CLM-1小鼠的完整海马组织实验得到验证。
图2 新生儿惊厥诱导的氯离子积聚及反复发作的促进机制
a图显示新生期（出生后5天）CLM-1小鼠离体完整海马体CA3锥体细胞层的细胞外场电位记录。通过低镁人工脑脊液诱导反复惊厥发作，并采用正常人工脑脊液灌流终止发作。
b图显示反复惊厥对细胞内氯离子浓度的影响。通过CA3神经元的双光子共聚焦YFP成像（左图）获得惊厥前、首次发作后、第四次及第八次发作后的细胞内氯离子浓度伪彩图。
c图显示36个鉴定神经元在惊厥前（深蓝色）、经历一次（绿色）、四次（橙色）和八次（红色）反复发作后的细胞内氯离子浓度分布（组距为10毫摩尔）。
d图显示在低（0-10毫摩尔）、中（10-20毫摩尔）和高（20-30毫摩尔）三个基础氯浓度区间的神经元亚群中，平均细胞内氯离子浓度的相应变化。
e-g图展示惊厥诱导的反复发作促进现象：
e图显示发作间期随反复发作次数增加而逐渐缩短；
f图显示三次连续惊厥发作在1-1000赫兹频段的功率谱；
g图显示惊厥发作功率随发作次数增加的对应变化关系。
二、材料与方法
动物实验方案均遵循美国国立卫生研究院及马萨诸塞总医院比较医学中心关于实验室动物使用的指导原则。离体电生理实验采用出生后5-7天的CLM-1转基因小鼠幼崽（雌雄兼用）及出生后3-6天的斯普拉格-达利大鼠雄性幼崽，按既往方法制备完整海马组织。实验动物经麻醉后断头取脑，迅速置于充氧（95%氧气与5%二氧化碳混合气）的冰镇人工脑脊液中，其成分包含（单位毫摩尔）：126氯化钠、3.5氯化钾、2氯化钙、1.3氯化镁、25碳酸氢钠、1.2磷酸二氢钠及11葡萄糖（pH值7.4）。分离大脑半球后，切除小脑、新皮层前部及周围结构，从隔海马复合体中精细分离出完整海马体。将海马体置于充氧人工脑脊液中，于室温（20-22摄氏度）下孵育1-2小时后转入常规浸没式记录槽，持续灌注32摄氏度恒温充氧人工脑脊液（流速4毫升/分钟）。
图3 惊厥发作次数依赖的GABAA受体激动剂异胍定对多单元活动及癫痫样放电的影响变化
a-b图显示新生期（出生后5天）CLM-1小鼠离体完整海马体CA3锥体细胞层的细胞外场电位记录。通过低镁人工脑脊液诱导反复惊厥发作。在经历1次发作后应用异胍定（10 μM，持续1分钟）可降低神经元放电频率；而在经历2次和3次发作后应用相同剂量的异胍定，则会瞬时增加神经元放电频率，并伴随发作间期癫痫样放电频率的短暂升高。
c图显示相应的标准化多单元活动频率。异胍定的兴奋性作用随反复惊厥发作次数增加而增强。红色曲线代表20个数据点的相邻平均值，b图和c图中的垂直虚线标示异胍定的给药时段。
采用涂覆钨丝微电极（直径50微米，California Fine Wire品牌）配合低噪声多通道放大器记录细胞外场电位，同步采集脑电图频段（0.1-100赫兹）、波纹振荡（100-200赫兹）、快速波纹振荡（200-500赫兹）及多单元活动（500赫兹高通滤波）。电极在灌流液中的均方根噪声水平通常为3-4微伏，而从锥体细胞层记录到的动作电位幅度可达60-80微伏。信号经模数转换器采集后，使用pClamp 9.2、Mini Analysis 5.6及Origin 7.5 SR6软件进行数据获取与分析。功率谱分析采用汉明窗函数处理，通过计算1-1000赫兹频段信号的均方根值进行功率积分。组间数据以均值±标准误表示，采用t检验、方差分析、卡方检验及曼-惠特尼U检验进行统计学分析，显著性水平设定为p≤0.05。
图4 苯巴比妥对新生儿惊厥的作用呈现发作依赖性变化
a图显示低镁人工脑脊液在离体完整海马体中诱导的反复惊厥发作。
b图显示在经历一次发作样事件后应用苯巴比妥（100 μM），可终止新生期海马体的惊厥发作。
c图显示在经历五次发作样事件后应用相同剂量苯巴比妥，则无法阻断低镁人工脑脊液中的反复发作样活动。
a-c图实验均在新生期（出生后5-6天）大鼠离体完整海马体CA3锥体细胞层进行细胞外场电位记录。
d图显示在对照组低镁人工脑脊液和苯巴比妥给药条件下，反复发作频率与既往发作次数的函数关系。在经历1次和3次发作后应用苯巴比妥可显著降低反复发作的平均频率（*p ≤ 0.05），而在经历超过5次发作后给药则无法降低发作频率.
e图显示苯巴比妥（100 μM）终止低镁人工脑脊液中惊厥发作的海马体比例，与给药前发作次数的关系图。苯巴比妥对新生儿惊厥的疗效随既往发作次数增加而递减。
氯离子成像实验采用表达氯离子敏感荧光蛋白Clomeleon的转基因CLM-1小鼠。按前述方法制备新生期（出生后5-7天）小鼠完整海马体，室温充氧人工脑脊液孵育不少于1小时。将海马体置于显微镜载物台上的浸没式记录槽中，在同步记录细胞外场电位的同时进行双光子Clomeleon成像。使用奥林巴斯Fluoview 1000MPE系统配备钛蓝宝石锁模激光器（860纳米激发波长），通过二向色镜（截止波长460纳米）和带通滤光片分别采集青色荧光蛋白（480±15纳米）与黄色荧光蛋白（535±20纳米）信号。图像采样深度为海马体表面下20-200微米，惊厥实验中的成像在发作终止1分钟后进行以规避pH值波动对荧光的影响。采用美国国立卫生研究院ImageJ 1.40g软件对三维图像栈进行定量分析，通过计算黄色荧光蛋白与青色荧光蛋白强度比值推算出细胞内氯离子浓度。
其中R代表实测的YFP/CFP荧光强度比值，KD表示Clomeleon探针的表观解离常数，Rmax为探针未结合氯离子时的理论比值，Rmin则为探针被氟离子完全淬灭时的比值。研究人员通过使用已知氯离子浓度的标准溶液（细胞外氯离子浓度分别为20、80和123毫摩尔）进行校准，确定了KD、Rmax和Rmin这三个常数值。在校准过程中，采用钾离子/氢离子载体尼日利亚菌素（50微摩尔）和氯离子/氢氧根反向转运体氯化三丁基锡（100微摩尔）消除跨膜氢离子/氢氧根及氯离子浓度梯度。通过记录神经元在不同细胞外氯离子浓度下YFP/CFP荧光强度的变化数据，将不同氯离子浓度下获得的数据点代入上述公式的比率计量函数形式进行拟合计算。
在公式中，Rmax和KD作为自由参数，Rmin则通过使用123毫摩尔氟离子淬灭Clomeleon荧光的方法确定。研究人员以单细胞分辨率对47个神经元进行了全校准条件追踪，计算出KD值为91±5.43毫摩尔，Rmax为1.026，Rmin为0.268。
图5 NKCC1在惊厥诱导的氯离子积聚及反复发作促进中的作用
a图上部显示在对照组和NKCC1阻断剂布美他尼（10 μM）存在条件下，低镁人工脑脊液诱导的反复惊厥发作。实验在新生期（出生后5天）CLM-1小鼠离体完整海马体CA3锥体细胞层进行细胞外场电位记录。下部为CA3神经元的双光子共聚焦YFP成像示例（左图）及布美他尼存在条件下惊厥前、两次发作后和九次发作后的细胞内氯离子浓度伪彩图。
b图显示48个鉴定神经元在惊厥前（黑色）、对照组低镁溶液中两次发作后（红色）及布美他尼存在下九次发作后（绿色）的细胞内氯离子浓度分布（组距为10毫摩尔）。高斯拟合得出均值±宽度值：对照组22.1±19毫摩尔，2次发作后29.8±18.4毫摩尔，9次发作后44.4±24.1毫摩尔。
c图显示在低、中、高三个基础氯浓度区间的神经元亚群中，惊厥诱导的平均细胞内氯离子浓度变化。布美他尼阻断了惊厥诱导的神经元氯离子积聚。
d图显示反复发作对对照组低镁人工脑脊液和布美他尼存在条件下细胞内氯离子积聚的影响。实线代表线性回归[对照组低镁人工脑脊液（黑色）：r=0.97±1.66; p=0.03；布美他尼组（绿色）：r=-0.43±2.6; p=0.57]。在低镁人工脑脊液中，细胞内氯离子浓度随反复发作次数增加而逐步上升，布美他尼阻止了这种进展性氯离子积聚。
e-f图显示平均发作间期和发作功率随反复发作次数的变化关系。
e图实线代表平均发作间期的线性回归拟合[对照组（黑色）：r=-0.82±1.37; p=0.02；布美他尼组（绿色）：r=-0.55±0.7; p=0.2]。
f图对应标准化平均功率的线性回归拟合[对照组（黑色）：r=0.95±0.07; p=0.0003; n=8；布美他尼组（绿色）：r=0.08±0.08; p=0.85; n=8]。
布美他尼有效阻止了发作功率和频率的进展性增强。
由于离子浓度呈对数正态分布，伪彩色图像中采用细胞内氯离子浓度的对数值均值。根据能斯特方程计算氯离子反转电位，温度参数设定为33摄氏度。
图6 NKCC1在惊厥诱导的GABA作用改变中的角色
a-b图显示新生期（出生后5天）小鼠离体完整海马体CA3锥体细胞层的细胞外场电位记录。在NKCC1阻断剂布美他尼（10 μM）存在条件下，通过低镁人工脑脊液诱导反复惊厥发作。在惊厥发作后及发作后抑制期恢复后应用异胍定（10 μM，持续1分钟），可瞬时降低神经元放电频率。
c图显示相应的多单元活动频率。垂直虚线标示异胍定应用时段，红色曲线代表20个数据点的相邻平均值。
布美他尼阻断了惊厥诱导的GABAA受体激动剂异胍定对多单元活动和癫痫样放电影响的改变（参见图3）。
在离体海马体癫痫持续状态模型中，可同时观察到GABA的兴奋性与抑制性反应。为解决锥体层细胞密集导致细胞外记录难以分辨单个神经元活动差异的难题，研究人员采用双光子钙成像技术。该技术通过负载钙敏感染料，可同步观测数百个神经元的单细胞活动，从而精准解析GABA反应的细胞间异质性及反复惊厥后的响应模式转变。其高空间分辨率支持对同一细胞进行多条件追踪，实现自身对照研究。
通过双光子显微镜可视引导，将0.8毫摩尔 Oregon Green 488 BAPTA-1 AM钙探针与星形胶质细胞特异性标记物磺基罗丹明101共同注入完整海马体150-300微米深度。在持续压力喷射（5-20 psi，60-150秒）后，经0.5-1小时孵育完成染料负载，单次注射可标记直径300微米球形区域内数百至数千个细胞。
图7 钾离子浓度梯度调控NKCC1活性
a-e图显示在钠通道阻断剂河豚毒素（1 μM）存在条件下，细胞内氯离子分布随细胞外钾离子浓度变化的情况。
a和c图展示CA3神经元的双光子共聚焦YFP成像（左图）及在不同细胞外钾浓度（3.5、8.5和13.5毫摩尔）下对照组（a）与布美他尼处理组（c）的细胞内氯离子浓度伪彩图。
b和d图分别显示对照组（b；30个鉴定神经元）和布美他尼处理组（d；40个鉴定神经元）对应的细胞内氯离子浓度分布（组距为5毫摩尔）。数据采用高斯函数进行拟合。
e图显示在对照组和布美他尼处理组中，平均细胞内氯离子浓度随细胞外钾离子浓度变化的函数关系。
使用与Clomeleon成像相同的显微镜系统进行延时钙成像。通过美国国立卫生研究院ImageJ、Matlab及Excel软件进行图像分析，自动识别细胞并提取时序数据。实验平均可同步监测约200个神经元。通过磺基罗丹明101信号区分星形胶质细胞，根据电刺激前后荧光强度变化判定细胞响应。在联合应用犬尿烯酸、CGP 55845及SR 95531的条件下，若细胞响应显著增强则判定为受GABA抑制。
图8 惊厥诱导的GABA作用改变不依赖于NMDA受体
a图显示反复应用海人酸（1 μM，持续5分钟；空心柱）可诱发发作期样癫痫样放电（惊厥），随后出现自发性发作间期放电。短暂应用异胍定（10 μM，持续1分钟；实心柱）可瞬时增加发作间期放电频率。
b图显示灌流非竞争性NMDA受体拮抗剂MK801（20 μM）可抑制海人酸诱导的惊厥。此时应用异胍定仍能增加自发性发作间期放电频率。
c图显示同时灌流MK801和布美他尼（10 μM）可显著抑制海人酸诱导的惊厥，并阻止GABA作用的兴奋性转变。此时应用异胍定会降低多单元活动频率和/或发作间期放电频率。
a-c图实验均在新生期（出生后5-6天）小鼠完整海马体CA3锥体细胞层进行细胞外场电位记录。
d图显示在对照组（方形）、MK801组（圆形）以及MK801与布美他尼联合组（三角形）中，海人酸诱导惊厥的标准化功率（均值±标准误）。
e图显示异胍定对自发性发作间期放电频率的影响。
研究人员通过对比惊厥前后三种条件（对照组、犬尿烯酸+CGP 55845组、犬尿烯酸+CGP 55845+SR 95531组）下468个细胞的响应特性，发现423个神经元受GABA抑制。通过分析二元响应概率与峰值ΔF/F变化，确定了响应极性转换（即从抑制转为兴奋）的细胞比例，并建立了初始诱发反应强度与极性转换概率的相关性。
蛋白质免疫印迹实验采用4-15%梯度SDS-PAGE胶分离蛋白样品，转膜后使用兔源R5抗磷酸化NKCC1抗体（1:500）和抗α-微管蛋白抗体（1:500）进行孵育，随后与HRP标记的二抗反应，通过ECL-Plus化学发光法检测。
图9 反复惊厥通过NKCC1依赖性机制逆转GABAA受体功能
a图显示通过短暂灌流GABAA受体拮抗剂SR 95531（10 μM）可诱导自发性惊厥（癫痫持续状态）。底部为放大时间尺度的自发性癫痫样放电活动。
b-c图显示GABAA受体激动剂异胍定对多单元活动和自发性癫痫样活动的影响。在正常人工脑脊液中，应用异胍定（10 μM）可降低多单元活动频率。而在自发性惊厥开始30-40分钟后，异胍定反而增加多单元活动频率和发作间期癫痫样放电。异胍定对群体活动的兴奋作用在惊厥终止后仍持续至少1-2小时。
c图显示布美他尼（10 μM）可阻止异胍定对多单元活动和发作间期癫痫样放电的兴奋作用。
a-c图实验均在新生期（出生后4-5天）完整海马体标本的CA3锥体细胞层进行细胞外多单元活动和群体活动记录。
d-e图显示在自发性惊厥前、中、后阶段，正常人工脑脊液和布美他尼存在条件下多单元活动的平均频率。
d图展示异胍定对多单元活动频率影响的时间进程。布美他尼（10 μM）可预防惊厥诱导的GABAA受体激活效应逆转。
三、结果
研究人员采用完整海马体标本以保持神经元网络完整性，避免切片制备过程中可能因神经元损伤和轴突切断导致的氯离子转运及细胞内氯浓度改变。通过对出生后5-7天表达Clomeleon的转基因CLM-1小鼠进行高分辨率双光子氯成像，发现完整海马体中CA3锥体细胞和中间神经元的静息细胞内氯浓度存在1-40毫摩尔的广泛差异。高斯拟合显示这种异质性意味着部分神经元的氯离子平衡电位低于静息膜电位，另一部分则高于静息膜电位，表明发育中神经元同时存在超极化与去极化两种GABAA受体介导的信号传递。
图10 新生儿惊厥改变突触GABAA受体激活效应
a-c图显示在对照组和惊厥状态下抑制突触兴奋性与抑制性对自发性神经元放电频率的影响。在对照组(a)中，联合应用KYNA（2 mM）与CGP 55845（1 μM）可降低完整海马体CA3锥体细胞层的多单元活动平均频率。随后在存在KYNA和CGP 55845条件下加入GABAA受体拮抗剂SR 95531，可增加多单元活动频率，证明内源性GABA激活GABAA受体时产生净抑制效应。
b图显示通过短暂应用SR 95531（2-3分钟）诱导自发性惊厥。在SR 95531洗脱后经历30分钟自发性惊厥活动，应用KYNA和CGP 55845可终止反复发作并降低多单元活动频率。此时再应用SR 95531不会改变多单元活动的平均频率。红色曲线表示平均多单元活动频率。SE指癫痫持续状态。
c图显示多单元活动频率比值[SR 95531/(KYNA+CGP 55845)]随惊厥发作次数增加而发生逆转。实线为对应的线性回归拟合（r=-0.98; p=0.02）。
d-e图显示P5完整海马标本CA3锥体细胞层的同步细胞外场电位与双光子钙成像。在对照组(d)中，联合应用KYNA（2 mM）和CGP 55845（1 μM）可抑制大多数CA3神经元的钙信号（ΔF/F）。随后在存在KYNA和CGP 55845条件下加入SR 95531（10 μM），可增强大多数细胞的ΔF/F。在离子型谷氨酸和GABA受体被阻断情况下出现的钙信号增强，可能源于代谢型受体激活和直接电刺激。
e图显示经历自发性惊厥后，SR 95531对ΔF/F的影响在约50%的神经元中发生逆转。
f-g图显示对照组和惊厥后状态下，药物应用期间群体平均钙响应（ΔF/F）及具有刺激诱导钙响应增加的细胞比例。*p ≤ 0.05。
h图表明经历反复惊厥活动后，近半数神经元丧失了对内源性GABA的抑制性响应，或将其抑制性响应逆转为兴奋性响应。
通过细胞外多单元活动记录发现，GABAA受体选择性激动剂异胍定可瞬时抑制91.5%的自发神经元放电，证实完整海马网络中GABAA受体激活总体呈抑制效应。这与海马切片中普遍观察到的去极化氯平衡电位及GABA兴奋作用形成鲜明对比。
持续灌流低镁人工脑脊液可诱发反复发作间期和发作期样癫痫样放电，其频率和功率随发作次数逐渐增加。通过同步氯成像与场电位记录发现，CA3锥体细胞内氯浓度随惊厥发作次数增加而逐步累积：经历1-2次发作后35%的神经元氯离子累积超过10毫摩尔，7-8次发作后该比例升至71%。这种变化足以使氯离子平衡电位超过静息膜电位，导致GABA能信号从抑制转为兴奋。该现象可被钠通道阻断剂河豚毒素消除，证实氯离子累积是惊厥活动直接导致。
为验证细胞内氯浓度升高是否改变GABAA受体功能，研究人员观察了异胍定对多单元活动的影响。在首次发作后给药可抑制神经元活动，而经历2-3次发作后则短暂增强多单元活动和发作间期放电频率，4-6次发作后甚至可诱发发作期样放电。这表明新生儿惊厥会逆转GABAA受体介导的信号极性，从抑制转为短暂兴奋。
进一步研究苯巴比妥的抗惊厥疗效与发作次数的关系发现：在经历1次发作后给药可使50%的实验终止发作，但经历6-8次发作后该比例降至9%。苯巴比妥对场电位功率的抑制率也从初次发作后的81.8%降至七次发作后的45%。这些数据证实新生儿惊厥会逐步降低苯巴比妥的抗惊厥效能，且其疗效与既往发作次数呈负相关。
01.NKCC1协同转运蛋白参与惊厥诱导的氯离子积聚及反复发作的促进机制
未成熟神经元高表达的NKCC1电中性协同转运蛋白可介导钠、钾和氯离子的内流。为评估NKCC1在惊厥性氯离子积聚中的作用，研究人员在新生CLM-1小鼠完整海马体模型中，于低镁人工脑脊液诱发首次或第二次发作后灌流NKCC1拮抗剂布美他尼。结果显示，布美他尼不仅显著降低惊厥引起的平均细胞内氯离子浓度升高幅度，还将氯离子累积超过基线10毫摩尔的细胞比例从对照组的71%降至31%。
布美他尼同时阻断了低镁人工脑脊液诱导的反复发作在功率和频率上的进展性增强。在联合应用低镁溶液与布美他尼的1小时内，发作间期和发作期样事件的功率均无显著变化。进一步研究发现，布美他尼能有效阻止惊厥引发的GABA作用转变：在经历2-3次乃至4-6次反复发作后，异胍定仍保持对多单元活动的抑制效应，未出现癫痫样放电的诱发。
关于反复发作中NKCC1活性增强的潜在机制，蛋白质免疫印迹检测证实惊厥状态下海马组织中NKCC1存在磷酸化激活。值得注意的是，惊厥活动引起的细胞外钾离子浓度升高（可达12.5毫摩尔）可通过影响NKCC1转运平衡促进细胞内氯离子积聚。在河豚毒素存在条件下，提高细胞外钾浓度可引发相应的细胞内氯浓度上升，该效应可被布美他尼显著抑制。
为探究NMDA受体在GABA作用逆转中的角色，研究人员采用海人酸模型进行研究。发现反复给予海人酸可诱导发作间期和发作期样放电，且异胍定能短暂增强自发性癫痫样放电频率，表明惊厥已诱发GABA作用转变。联合应用非竞争性NMDA受体拮抗剂MK801后，虽惊厥活动功率逐渐减弱，但异胍定仍能短暂增强放电频率。而在同时使用MK801与布美他尼的条件下，异胍定则完全抑制自发性癫痫样放电。这些结果证实，惊厥诱导的NKCC1依赖性氯离子积聚及GABA兴奋性转变不依赖于NMDA受体激活。
本研究揭示了NKCC1在新生儿惊厥中通过介导神经元氯离子积聚促进发作反复的关键作用，为靶向NKCC1的治疗策略提供了理论依据。
02.GABAA受体拮抗剂的长期促惊厥作用
在出生后4-6天的大鼠完整海马体模型中，GABAA受体拮抗剂SR 95531的短期应用可快速诱发发作间期和发作期样癫痫样放电，并在药物洗脱后仍能维持30-60分钟的自发性癫痫样活动。这种持续数小时的异常放电现象提示，GABAA受体阻断可能通过活动依赖性的突触可塑性改变，而非药物残留效应，诱导了神经网络的长时程改变。
03.反复惊厥通过NKCC1机制改变GABA能信号
在基础状态下，GABAA受体激动剂异胍定可显著抑制63.4%的多单元活动。但在经历GABAA受体拮抗剂诱发的自发性癫痫样放电后，同一激动剂反而使多单元活动频率增加60.3%，并伴随发作间期放电频率的短暂升高。这种GABA作用的双相转变在发作终止后仍可持续1-2小时。值得注意的是，当联合应用NKCC1阻断剂布美他尼时，异胍定始终保持抑制效应，证实惊厥诱导的GABA功能转变依赖于NKCC1介导的氯离子调控机制。
04.NKCC1依赖性改变决定自发性发作进程
为验证NKCC1依赖性改变是否促进后续发作，研究人员观察了布美他尼对GABAA受体拮抗剂诱导的癫痫持续状态的影响。结果显示，布美他尼处理组的自发性放电持续时间较对照组显著缩短（31.3分钟 vs 41.7分钟），且对脑电功率的抑制效应随发作进程从初始的10%逐渐增强至45%。这表明新生儿惊厥通过NKCC1依赖性氯离子积聚机制，逐步提高后续发作易感性。
05.新生儿惊厥改变突触GABA反应极性
通过药理学分离兴奋性与抑制性突触传递，发现基础状态下内源性GABA对CA3神经网络呈净抑制效应。但在经历惊厥后，GABAA受体阻断对神经元放电频率的影响呈现三种模式：增强、无变化或减弱。统计分析显示，随着发作次数增加，GABA对神经元放电的抑制效应呈线性下降，经历3-4次发作后甚至转为兴奋作用。
06.GABA调控细胞内钙信号的细胞特异性
采用钙成像技术在单细胞分辨率下分析发现，在经历惊厥后，约43%的神经元发生GABA反应极性转换——从抑制性转变为兴奋性或无反应。这种异质性转变与NKCC1介导的氯离子平衡电位正移密切相关，但不同神经元的表现存在明显差异。
本研究系统阐明了新生儿惊厥中NKCC1依赖性氯离子积聚通过改变GABA能信号极性，形成促进发作持续的正反馈循环机制。这一发现为靶向NKCC1的新生儿惊啸治疗策略提供了重要理论依据。
四、讨论
本研究结果证实，NKCC1活性在反复惊厥诱导的神经元内氯离子积聚过程中起关键作用。惊厥活动引起的细胞外钾离子浓度升高，通过改变NKCC1转运平衡点，足以导致细胞内氯浓度的短期变化。这一机制引发GABAA受体激活的净效应从抑制向兴奋的持续性转变，进而促进惊厥反复发作并加剧氯离子积聚。在此病理状态下，GABA能抗惊厥药疗效下降，而NKCC1拮抗剂布美他尼（尤其与苯巴比妥联用时）展现出显著治疗效果。
研究揭示了不同实验模型中布美他尼疗效差异的内在机制：其抗惊厥效果随惊厥发作次数增加而增强。这解释了为何在早期给予GABA能药物（当细胞内氯浓度较低且GABA仍呈抑制效应时）可有效阻断"惊厥-去抑制-再发惊厥"的正反馈循环。关于NKCC1激活机制，数据显示惊厥活动主要通过改变跨膜离子梯度而非调节转运蛋白磷酸化状态来增强其活性。细胞外钾升高驱动的氯内流是主要途径，但通过GABAA受体的氯负载也可能参与其中。
特别值得注意的是，完整海马体与脑切片标本中GABA效应存在显著差异，这源于切片制备过程中的机械损伤导致的氯浓度改变。研究还发现GABAA受体激动剂对网络活动的双相作用：初始去极化后随着氯持续内流最终实现抑制，这为临床大剂量GABA能药物治疗新生儿惊厥提供了理论依据。
这些发现对理解新生儿惊厥自然病程具有重要意义。前瞻性脑电图研究显示，脑损伤相关惊厥在损伤后数小时出现并可持续72小时。缺氧/低血糖损伤后NKCC1介导的神经元氯浓度延迟性升高，以及体内损伤后NKCC1转录上调持续72小时的现象，共同表明NKCC1活性增强及随之而来的GABA能抑制功能受损，是缺氧缺血性脑损伤后新生儿惊厥时序进程的重要决定因素。这解释了为何早期脑电图诊断和治疗未能显著提升苯巴比妥疗效——当首次惊厥发作时，NKCC1活性可能因先前缺氧而已处于升高状态。一个重要悬而未决的问题是：预防性使用布美他尼能否降低新生儿惊厥的发生率或严重程度？
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